一株生防烟管菌几丁质酶表达及抗真菌活性（二） 丁质达及在离体和活体条件下

3结果与分析

3.1烟管菌的株生抗病能力分析

以烟草为寄主，检验烟管菌对由灰葡萄孢引起的防烟灰霉病，由链格孢引起的管菌赤星病和黑斑病的抑制效果进行抗病表型实验（表3）。结果表明，丁质达及在离体和活体条件下，酶表烟管菌能够使灰霉病病斑面积分别减少91.97%和100%；使赤星病病斑面积减少77.12%和75.03%。菌活而在黑斑病的株生实验组中，离体条件下并未观察到明显的防烟抗病效果；活体接种病原菌时，多次重复未检测到明显发病迹象。管菌

烟草灰霉病、烟草赤星病和烟草黑斑病分别由灰葡萄孢、酶表链格孢和细极链格孢引起烟草叶片的菌活病斑面积测量后，被用以比较烟管菌对上述三种病害的株生抗病能力数据使用单因素方差分析，“*”表示差异显著（P<0.001）。防烟

3.2生物信息学分析

对该菌株的管菌基因组进行分析，发现烟管菌该菌株具有11个几丁质酶基因，12个β-1，3-糖苷酶基因。其中5个几丁质酶基因（EVM0010419；EVM0005032；EVM0003995；EVM0003825；EVM0009013）和3个β-1，3-糖苷酶基因（EVM0006890；EVM0003791；EVM00010135）所对应的蛋白序列N端具有信号肽结构烟管菌几丁质酶基因的保守结构域分析表明，烟管菌几丁质酶基因均属于GH18基因家族。此外，EVM0005032和EVM0003825末端带有Chic_BD（aromaticchitin/cellulosebindingsiteresidues）结构，属于B类几丁质酶（CHIB）。

3.3几丁质酶基因和β-1，3-糖苷酶基因的表达谱分析

RT-qPCR分析对峙培养第6d的烟管菌细胞壁裂解酶基因的表达水平结果表明在该阶段，多个基因表达量上调，如几丁质酶基因EVM0005032，EVM0003825和EVM0009013，β-1，3-糖苷酶基因EVM0006890（图2）。尤其是几丁质酶基因EVM60005032（BaCHIB），在与链格孢、茄链格孢、灰葡萄孢和尖孢镰刀菌的对峙培养时，该基因分别上调表达27.3倍、31.7倍、50.3倍和41.3倍（图2B），但在与链格孢苹果专化型和细极链格孢相互作用时，该基因未发生相应的上调表达。总体上来看，除基因EVM0005032外，其它基因上调的情况主要集中在烟管菌与茄链格孢和尖孢镰刀菌的对峙培养中，如基因EVM0009013和EVM0006890在应对茄链格孢时表达上调（图2e，2f）。另外，同属B类几丁质酶基因的EVM0003825仅在与尖孢镰刀菌的对峙培养中出现明显的上调表达（图2d）。

3.4几丁质酶BaCHIB的抗真菌活性

使用镍柱对重组蛋白BaCHIB进行了分离纯化，在咪唑浓度为80mmol/L时目的蛋白能被高效洗脱，并在后续的SDS-PAGE中显示为单一条带（图3）。大小在50～70kD之间，与预测分子大小63.6kD相近。对纯化后的重组蛋白进行活性测定，在37℃下几丁质酶活性约为17.7U/mg。

对几丁质酶BaCHIB进行抗真菌活性测试，经48h温育，相较于对照组，添加BaCHIB的实验组中，链格孢、茄链格孢和灰葡萄孢均无新生菌丝生长的痕迹，表现出明显的生长抑制作用。

图2接种6d后烟管菌预测具有信号肽结构的细胞壁裂解酶基因相对表达量分析将烟管菌单独培养作为对照组；A1为链格孢；A2为链格孢苹果专化型；A3为茄链格孢；A4为细极链格孢；B灰葡萄孢；F为尖孢镰刀菌.根据多重比较结果，不同字母表示差异显著（P≤0.05）。

图3重组蛋白BaCHIB的纯化

4讨论

本研究通过离体和活体实验，证明了烟管菌对烟草灰霉病和赤星病具有良好的抗病效果。但在烟草黑斑病的离体侵染4d后，烟管菌施用与否对发病面积并无明显影响，说明在离体条件下烟管菌对烟草黑斑病没有抗病效果，而在活体实验中，实验组和对照组均无病斑的发生，该现象可能由于使用的细极链格孢菌株侵染能力较弱，导致侵染后无感病表型出现。

生防微生物通过分泌细胞壁裂解酶抑制病原菌的生长是其发挥生防作用的主要机制之一，如几丁质酶，β-1，3-糖苷酶，脂肪酶和蛋白酶，这些酶体通常在破坏病原体的细胞壁中起着至关重要的作用。为了初步探究烟管菌细胞壁裂解酶在烟管菌抗病中的作用，本研究通过生物信息学和RT-qPCR的角度出发，对烟管菌部分细胞壁裂解酶进行分析。

GH18家族广泛存在于原核生物，真核生物乃至病毒中。按照结构域差异可分为两大类：ClassIII（B类）和ClassV（A类）。其中B类几丁质酶含有几丁质或多糖结合位点，这类几丁质酶主要参与真菌生长发育过程中的营养吸收，并在线虫和部分真菌寄生昆虫的过程中发挥重要作用。此外，该类几丁质酶基因结构与植物几丁质酶基因相似，而后者通常与寄主植物对病原细菌，真菌及线虫的抗性相关。由此可推测，烟管菌几丁质酶基因EVM0005032（BaCHIB）和EVM0003825可能在烟管菌对病原真菌的生物防治中发挥重要的生物学作用。

图4重组几丁质酶BaCHIB的抗真菌活性三角形图标指示琼脂块，箭头图标指示病原真菌新生菌丝。

使用RT-qPCR对预测具有信号肽结构的几丁质酶基因和β-1，3-糖苷酶基因的表达谱进行分析测定，借此筛选出可能具有抗真菌活性的细胞壁裂解酶基因。在对峙培养过程中，多个基因在接种6d后表达量上调，特别是，几丁质酶基因EVM0005032。结果表明部分植物真菌性病原，如链格孢，茄链格孢，尖孢镰刀菌和灰葡萄孢，能够直接诱导烟管菌细胞壁裂解酶基因的表达。这一结果与Banani等的研究相似，桃梅奇酵母（Metschnikowiafructicola）菌株AP47在桃褐腐病菌（Moniliniafructicola）细胞壁提取物诱导下，其几丁质酶基因MfChi上调表达14倍，并在后续的实验中表现出对桃子褐腐病的显著抑制能力。此外，Essghaier等在研究一种嗜盐菌对草莓灰霉病的防治过程中，发现枯草芽孢杆菌能够分泌多种具有抗真菌活性的酶类：几丁质酶，β-1，3-糖苷酶，纤维素酶和蛋白酶；Urbina等在其研究中也发现橄榄假丝酵母分泌的一种β-1，3-糖苷酶对苹果病原菌扩展青霉具有拮抗能力。上述研究为烟管菌几丁质酶BaCHIB具有抗真菌活性的假设提供了相应的依据。另一方面，同属于B类几丁质酶的基因EVM0003825，仅在烟管菌与尖孢镰刀菌的对峙培养中出现上调表达，而未出现类似于BaCHIB在应对多种病原真菌时的高表达现象，这一结果说明，几丁质酶基因BaCHIB可能在应对病原真菌具有一定的特异性。

结合抗病效果与几丁质酶基因BaCHIB的诱导表达分析，表明烟管菌对植物真菌病害抗病表现与BaCHIB的诱导表达情况的出现高度同步。如烟管菌对烟草灰霉病和赤星病具有抗病能力，几丁质酶基因BaCHIB在与灰葡萄孢和链格孢的对峙培养中出现诱导表达；对烟草黑斑病没有显著的抗病效果，BaCHIB不出现显著的诱导表达。这一结果为几丁质酶基因BaCHIB在烟管菌的生物防治中发挥重要作用提供了又一关键证据。

通过真核外源表达系统，烟管菌几丁质酶BaCHIB能够被成功表达和纯化。并表现出几丁质酶活性和良好的抗真菌活性。这一结果验证了几丁质酶BaCHIB具有抗真菌能力在Ahmed等的研究中，绿色木霉几丁质酶在浓度为2.23mg/mL时，对尖孢镰刀菌培养5d后的抑菌能力为45%；而另一种来自珊瑚球菌的几丁质酶，在浓度为0.15mg/mL和0.75mg/mL时，对稻瘟病菌分生孢子萌发抑制率分别在40%和10%左右；而来源于哈茨木霉的几丁质酶Chit46，在浓度为3.9μg/mL时，对灰葡萄孢培养5d后的生长抑制能力为76%，表现出较上述两种几丁质酶更为高效的抑菌能力在本研究中，三种病原真菌在0.2mg/mL的几丁质酶溶液中培养2d后，新生菌丝生长被强烈抑制，证明烟管菌几丁质酶BaCHIB同样具有较好的抗真菌能力。

本实验结果表明，具有生防能力的烟管菌BK-1可能是通过分泌几丁质酶BaCHIB实现其对一些植物真菌病害的抑制，但具体的生物防治机制，仍然需要在此基础上进行更加深入的研究。

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